FENO检测在支气管哮喘中的应用——FENO检测的原理及方法（上）
2010/12/06
龚颖 叶伶 金美玲
上海复旦大学附属中山医院呼吸科 200032
支气管哮喘（简称哮喘）是一种对患者及其家庭和社会都造成明显影响的慢性气道疾病。而气道的慢性炎症被认为是哮喘的基本病理改变，表现为以肥大细胞，嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞为主的多种炎症细胞在气道的浸润和聚集。这些细胞间的相互作用分泌出数十种炎症介质和细胞因子，分泌产物又与炎症细胞互相作用从而使气道炎症持续存在。
虽然目前哮喘尚不能根治，但以抑制炎症为主的规范化治疗能够有效地控制哮喘的临床症状。现今临床上主要依据患者的临床症状、肺功能检查（包括气道激发试验）等手段来诊断和监测哮喘。但这些指标不能直接反应气道的炎症水平。诱导痰分析虽能直接反映气道的炎症，但需要熟练的操作技术且存在一定的风险性，较难在临床中得到广泛的应用。现有很多研究表明呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide, FENO)与气道的炎症和高反应性存在显著的相关性，其对哮喘的诊断与治疗监测具有重要意义。
一、FENO来源
FENO是由多种细胞分泌产生，这包括上皮细胞、炎症细胞（巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞）、平滑肌细胞、气道神经以及血管内皮细胞等。但主要是由巨噬细胞和上皮细胞所分泌。
1.1 解剖来源
人体的整个呼吸道（包括传导气道和呼吸区）都可以合成一氧化氮（NO），其中来自上呼吸道的NO水平是下呼吸道的100倍以上。
有多个因素影响到上呼吸道中鼻窦的NO水平。在鼻窦的血管周围密布具有一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)活性的神经纤维，这是产生NO的主要来源。而研究证实具有强大血管收缩功能的神经肽Y可以使血流减少37%，但却只能使NO减少7%，这表明血管本身不是产生NO的主要来源。
通过纤支镜在气管和主支气管内取样测到的NO水平与在口腔内测到的相同。这提示FENO来源于下呼吸道，且最有可能来源于气道的上皮细胞而非肺泡的内皮细胞。
1.2 NOS
NO是NOS催化L-精氨酸氧化而产生的。NOS最少有3种不同的同工酶：神经型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。nNOS主要位于神经系统，eNOS则位于内皮细胞，此两种为结构型同工酶。其活性依赖于Ca2+/钙调素的调节，作用迅速而短暂，常被细胞内轻微的钙离子浓度升高而激活，主要参与调节机体的生理活动：在血压调节中舒张血管，还参与调节肺功能、心肌收缩、血小板聚集、胃肠系统与泌尿生殖系统等的功能。iNOS主要位于巨噬细胞，其活性取决于基因转录而非依赖于Ca2+/钙调素的调节，作用缓慢而持久，主要参与病理反应。三种同工酶在呼吸道中均有表达，其中iNOS可以在呼吸道上皮细胞内特异表达，且在哮喘患者中其表达显著增高。研究发现，与正常对照组相比，哮喘患者其呼吸道iNOS mRNA的表达会显著增高。正常情况下，结构型NOS发挥作用产生低水平的NO，肺炎状态时诱导型NOS发挥作用产生高水平的NO，而且干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白介素-1可以上调iNOS的表达，激素则下调其表达。研究证实，接受激素治疗的哮喘患者其iNOS蛋白和mRNA的表达水平与未接受治疗的患者相比有一定程度的降低。故而，哮喘患者因气道炎症的存在导致FENO升高，在使用激素后其水平会下降。
二、FENO检测
2.1 检测原理
由于NO的易逸性和不稳定性（其半衰期仅为2～6s，很容易被氧化为NO2），因此对其直接测定非常困难。目前应用最广泛，且最灵敏的测定FENO的方法是与臭氧(O3)反应的化学发光法，其灵敏度可至百万分之一(1ppb)。
化学发光法被认为是测定NO的标准方法。经典的测定NO的化学发光法是根据NO与O3反应生成的激发态NO2在返回基态的过程中释放能量而发光这一原理来进行测定。此方法的灵敏度较高，检出限为5ppb。但缺点是NO与O3的反应必须在气态进行，故而溶液中的NO必须用惰性气体将其气化提取出来。这一操作过程复杂，且该反应还易受氨气、硫化氢、烯类、二甲亚砜(DMSO)等的干扰，反应条件亦不容易被控制等因素的影响。后来对氧化剂进行改进，用过氧化氢(H2O2)代替O3，即鲁米诺法。NO可被H2O2强烈的氧化生成ONOO-，而ONOO-可使鲁米诺氧化并在溶液中发出很强的光。因为只有NO可以激发这一光化学反应，而NO2-和NO3-则不能，所以目前该方法是可以对溶液中的NO进行实时测定且检测灵敏度最高的方法。
2.2 检测方法
FENO通常是在对着一障碍物作单口呼气时测定，以防止混有鼻腔的NO成分。美国胸科协会推荐了成人及儿童FENO测量技术的标准，即采用标准化的测量仪器，测试对象吸入无NO的气体达到肺总量，然后呼出肺内气体，呼气时维持呼气流速在50ml/s（之所以设定固定的流速是由于FENO有流速依赖性)，从而使呼出气到达到一个稳定的平台期，再通过仪器得到测量结果。上述过程需要重复测量2次，且2次的测量结果要达到基本一致。
对于不能达到规定呼气流速的小于6岁的儿童则制定了离线检测标准，即选择呼吸阻力呼气的方法进行测定。儿童可以通过一个接口管向一个NO无活性的气球（例如聚酯薄膜气球）内吹气，同时通过5cm水压阻力呼气从而防止鼻部污染。离线潮式呼吸法可被用于不能配合前述方法的患者，例如：婴儿。应在平静规律的潮式呼吸时进行测定[1]。
2.3 检测的流速依赖性
FENO来源于支气管及肺泡两处。在呼气过程中，NO从支气管壁及肺泡腔向支气管腔流动，FENO浓度升高。正常状态下NO和血红蛋白有较高的亲和力，肺泡来源的NO水平较低且维持在一个稳定状态。当呼气流速较低时，NO有足够的时间从支气管壁向支气管腔内顺浓度梯度弥散，这时测定的FENO主要来源于支气管；当呼气流速较高时，NO经支气管壁弥散时间缩短，此时测得的较低水平的FENO主要来源于肺泡。因而，FENO的浓度具有流速依赖性。由于不同研究者采用的呼气流速不同，所得到的结果也就不同，从而使得FENO测定在哮喘的诊断及监测方面的研究受到一定限制。目前美国胸科学会/欧洲呼吸学会(ATS/ERS)制定了FENO测定指南，对其测定的流速做了限制，规定的流速为50ml/s[2]。
2.4 检测的重复性
FENO如要规范性地用于哮喘的临床检测，其首要条件就是检测结果具有良好的重复性。Kharitonov等人发现，使用“NIOX”NO测定系统取得了具有高度重复性的测定结果，NO测定的平均标准误仅为2.1ppb，这意味着可检测出由于炎症而引起的4ppb的FENO[3]（见图1）。
图1 FENO测定值重复性的Bland-Altman分析(n=637)。引自参考文献3。
三、FENO影响因素
在健康成人受试者中，FENO与年龄、肺功能和PEF日变化无关，但女性的FENO水平较男性低。而儿童的FENO水平随着年龄的增长而增加。FENO水平可以受呼吸方式、气道阻塞程度、含有硝酸盐的食物（如莴苣）和饮料、传染病、药物（如类固醇）、吸烟和锻炼等的影响，具体如下：
（1）空气中的NO（1～几百ppb）；
（2）鼻腔中高浓度的NO；
（3）呼气流速，在检测中要求保持恒定的呼气流速是因为呼气流速会影响FENO。呼气流速快会导致FENO水平下降；呼气流速慢，则FENO水平相对升高。一般推荐呼气流速维持在50ml/s，同时口腔压力应达到5～20cmH2O，以使软腭关闭，隔离鼻咽部；
（4）用力呼气可使FENO水平显著下降，并持续1h，故若要进行肺功能检查时，应先测定FENO，然后进行肺功能检查；
（5）组胺或乙酰甲胆碱诱发支气管痉挛后会立刻导致FENO水平的降低，所以激发试验应于FENO测定之后方可进行；
（6）吸烟者的FENO水平低于非吸烟者，并且一次吸烟即可使FENO水平暂时性降低；
（7）在食用富含硝酸盐的食物之后的一段时间内，FENO水平会有所增高，因此建议在测定FENO水平之前避免食用此类食物；
（8）运动、支气管扩张剂的使用、抗炎治疗等均会影响到检测结果；
（9）遗传变异可以影响FENO水平，NOS的多态现象与哮喘症状和IgE水平均有关系。其水平在个体间亦存在着相对较大的差异；
（10）患有不同的疾病可以影响FENO水平，例如哮喘和病毒感染与FENO水平上升有关，而囊性纤维化和纤毛运动障碍综合征与其水平显著降低有关。
四、FENO参考值
目前各个研究中心所得出的健康人群FENO参考值各不相同，缺乏统一的标准。依照ATS指导原则进行测定，健康人群的FENO水平通常在10到20ppb。然而多项研究显示，FENO水平在5到20ppb范围内的亦并不少见（见表1、2，引自参考文献4）。
表1 健康儿童FENO参考值
|
例数 |
FENO值(ppb) |
注释 | |
|
Franklin等人，2001年 |
12名婴儿 |
22.0 |
流速为40毫升/秒 |
|
Jobsis等人，2001年 |
73名儿童 |
10.5±1.1 |
在线方法 |
|
|
29名儿童 |
12.6±1.1 |
离线方法 |
|
Kharitonov等人，2003年 |
20名儿童 |
15.6±9.2 |
早晚测定 |
|
Kissoon等人，2000年 |
32名青少年 |
36.9±25.4 |
流速为46毫升/秒 |
|
Pedroletti等人，2000年 |
15名儿童 |
12.5±3.2 |
流速为48毫升/秒 |
|
Pijnenburg等人，2000年 |
20名男性儿童
14名女性儿童 |
4.9±1.2
7.6±1.1 |
离线方法
离线方法 |
|
Scollo等人，2000年 |
23名儿童 |
10.1±4.1 |
|
注：如无说明流速为50ml/s。
表2 健康成人FENO参考值
|
资料来源 |
例数 |
FENO值(ppb) |
注释 |
|
Chatkin等人，1999年 |
23名成年人 |
28.3 |
流速为45毫升/秒 |
|
Foresi等人，2000年 |
16名非吸烟者 |
20.2±2.4 |
流速为47毫升/秒 |
|
Kharitonov等人，2002年 |
10名成年人 |
17.8±6.8 |
连续测定五天。最后一天于四个不同的时间点进行测定 |
|
Malerba等人，2001年 |
19名成年人 |
9.3±2.8 |
|
|
Olin等人，2000年 |
65名成年人 |
20.4 |
|
|
Olin等人，2001年 |
202名非吸烟者
特异反应性
－ 无鼻炎
－ 有鼻炎
非特异反应性
－ 无鼻炎
－ 有鼻炎 |
14.7±2.3
31.1±7.6
15.5±0.9
18.1±1.8 |
于非花粉季节进行测定 |
|
Papi 等人，2000年 |
9名成年人 |
9.9 |
流速为67－83毫升/秒 |
参考文献见（下）篇
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